Микрофлора молочнокислых бактерии и дрожжей в 19-ти итальянских заквасок

Микрофлора молочнокислых бактерии и дрожжей 19 заквасок, используемых для традиционных/стандартных видов итальянского хлеба: взаимодействие между ингредиентами и разнообразие видов микробов

Фабио Минервини, Раффаэлла ДиКагно, Анна Латтанци, Мария Де Ангелис, Ливио Антониэлли, Джанлуиджи Кардинали, Стефан Каппелле и Марко Гоббетти

Оригинал статьи https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3273004/

Исследование микрофлоры 19 итальянских заквасок, используемых для изготовления традиционного хлеба, позволило идентифицировать при помощи культурально-зависимого подхода 20 видов молочнокислых бактерий (LAB) и 4 вида дрожжей. Численно, наиболее частыми изолятами молочнокислых бактерий были Lactobacillus sanfranciscensis (примерно 28% от общего количества изолятов LAB), Lactobacillus plantarum (приблизительно 16%), и Lactobacillus paralimentarius (около 14%). Saccharomyces cerevisiae были обнаружены в 16 заквасках. Также были обнаружены Candida humilis, Kazachstania barnettii, и Kazachstania exigua. Как показывает анализ основных компонентов (PCA), была обнаружена корреляция между ингредиентами, особенно типом муки, микробным сообществом и биохимическими особенностями закваски. Мука из твердых сортов пшеницы характеризовалась высоким уровнем мальтозы, глюкозы, фруктозы, и свободных аминокислот (FAA), коррелирующих с единственным или доминирующим наличием облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий, наименьшим количеством факультативно гетероферментативных штаммов и низкой плотностью клеток дрожжей в зрелых заквасках. Это исследование при помощи системного и сравнительного подхода выделило доминирующие микрофлоры 19 итальянских заквасок, которые определили некоторые особенности традиционных видов итальянского хлеба.

В последние десятилетия в Европе и во всем мире ценность традиционных стандартных продуктов питания значительно возросла. Традиционные – определение, используемое для продуктов питания, которые исторически являются частью культурного наследия людей, проживающих в определенном географическом районе (29а). Стандартные - определение, используемое для продуктов питания, производимых с использованием одного или нескольких ингредиентов, имеющих характеристики строго в зависимости от географической области, откуда они происходят (9). Главным образом из-за долгой истории регионального политического разделения около 200 различных видов хлеба производятся по всей Италии с большими различиями в рецептах и традициях изготовления (24). Некоторые виды хлеба уже получили защищенное обозначение происхождения (PDO) (Pane di Altamura и Pagnotta del Dittaino) или защищенное географическое указание (PGI) (Pane di Matera, Pane Casareccio di Genzano и Coppia Ferrarese). Несмотря на различия, почти все традиционные/стандартные виды итальянского хлеба делаются на закваске. Закваска представляет собой чрезвычайно сложную биологическую экосистему (19), где дрожжи и, особенно, молочнокислые бактерии в значительной степени определяют органолептические, технологические, питательные и функциональные особенности получаемых хлебобулочных изделий (20). В зрелых заквасках молочнокислые бактерии содержатся в количестве > 108 CFU g− 1, в то время как количество дрожжей, по крайней мере на один порядок ниже (19). Микробный состав закваски был подвергнут многочисленным исследованиям, которые выявили большое разнообразие видов (см. ссылки 15, 16, 22 и 43). В целом, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rossiae и Lactobacillus sanfranciscensis доминируют в процессах закваски, которые характеризуются низкой температурой инкубации и регулярным повторным использованием (традиционные закваски I типа). Промышленные закваски II типа характеризуются более высокой температурой, более длительной ферментацией и более высоким содержанием воды чем закваски I типа. Они содержат термофильные и кисло-устойчивые лактобактерии, такие как Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus pontis и Lactobacillus reuteri. Виды, относящиеся к родам Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, и Weissella изолируются реже (8, 41, 49). Другие исследования (29, 38) показали, что состав микрофлоры заквасок подвергается изменениям в зависимости от устойчивости штаммов и экологических факторов. Candida krusei, Candida milleri, Kazachstania exigua, Pichia norvegensis, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii и Wickerhamomyces anomalus (ранее Pichia anomala) являются дрожжами, наиболее часто встречающимися в заквасках (23, 27, 31, 39). Сравнительные исследования многочисленных заквасок, которые используются для изготовления различных традиционных/стандартных видов хлеба могут (i) определить ингредиенты и технологические факторы, способствующие стабильности микрофлоры и конкурентоспособности между молочнокислыми бактериями и дрожжами и (II) установить влияние микрофлоры на биохимические характеристики закваски (44).

Данное исследование было направлено на определение микрофлоры молочнокислых бактерий и дрожжей 19 итальянских заквасок, используемых для изготовления традиционных/стандартных видов итальянского хлеба. Доминирующие молочнокислые бактерии и дрожжи были изучены при помощи культурально-зависимых методов. Были проведены многопараметрические статистические исследования для того, чтобы найти корреляцию между ингредиентами и составом микрофлоры закваски, а также воздействием последних на биохимические характеристики закваски.

Было изучено 19 заквасок, используемых для изготовления традиционных/стандартных типов итальянского хлеба (таблица 1). Хлеб на закваске представлял несколько итальянских регионов (см. рис.S1 в дополнительных материалах). Таблица 1 обобщает ингредиенты и технологические параметры исследованных заквасок. Три партии каждой закваски брали три дня подряд из местных пекарен. Все образцы были взяты сразу в конце использования и хранились при температуре 4 °C в течение нескольких часов перед анализом. Все анализы проводились по крайней мере дважды для каждой партии закваски (всего шесть анализов для каждого типа закваски).

Определение рН, углеводов, органических кислот, этанола и свободных аминокислот.

Значения рН определялись с помощью рН-метра. Десять граммов неферментированного теста (мука и вода, выход теста [DY; (вес теста/вес муки) × 100] из 160) или зрелой закваски были гомогенизированы 90 мл буферного раствора Трис- HCl, 50 мМ (pH 8,8) и в течение 3 мин обрабатывались в гомогенизаторе BagMixer 400P (Interscience, Сен Ном, Франция). После инкубации (при температуре 25°C в течение 30 мин с помешиванием) суспензию центрифугировали (12 857 × г, 10 мин, 4 °C). Надосадочная жидкость (водорастворимый экстракт) была проанализирована на концентрацию углеводов (неферментированное тесто) и органических кислот (зрелая закваска). Они были определены жидкостной экспресс-хроматографией белков (FPLC) с использованием системы очистки ÄKTA (GE Healthcare Bio-Sciences, Уппсала, Швеция), оснащенной детектором коэффициента преломления (Perkin Elmer Corp., Уолтем, Массачусетс, США). Коэффициент ферментации (QF) был определен как молярное соотношение между D, L-молочной и уксусной кислотами. Концентрация этанола определялась ферментационным методом (EnzyPlus; BioControl Systems, Inc., США). Концентрация свободных аминокислот в водорастворимых экстрактах неферментированного теста и зрелой закваски определялись с использованием аминокислотного анализатора Biochrom 30 (Biochrom LTD, Кембриджский научный парк, Англия) (11). Смесь аминокислот с известной концентрацией (Sigma Chemical Co., Милан, Италия) была добавлена вместе с цистеиновой кислотой, метионинсульфоксидом, метионином сульфона, триптофаном и орнитином и была использована в качестве внешнего стандарта (11).

Перечисление и изоляция молочнокислых бактерий и дрожжей.

Десять граммов закваски были гомогенизированы 90 мл стерильным раствором пептонной воды (1% [масса/объем] пептон и 0,9% [масса/объем] хлорид натрия). Молочнокислые бактерии были подсчитаны и изолированы с помощью модифицированной питательной среды Мана-Рогоза-Шарпа (mMRS) (содержащей 1% [масса/объем] мальтозы, 5% [объем/объем] экстракта свежих дрожжей, pH 5,6), заквасочных бактерий (SDB), MRS5 (28), и глюкозы-М17 (содержащая 0,5% [масса/объем] глюкозы вместо лактозы) среды агар (Oxoid, Бейзингстоук, Хэмпшир, Великобритания). Все эти среды были обогащены циклогексимидом (0,1 г литра − 1). Чашки Петри инкубировали в условиях анаэробиоза (AnaeroGen и AnaeroJar, Oxoid) при температуре 30°C в течение 48 ч. Для каждой среды как минимум пять колоний были случайным образом выбраны с чашек Петри , содержащих два разведенных образца . Грамположительные каталазаотрицательные неподвижные изоляты палочек и кокков культивировали в mMRS, SDB, MRS5 или глюкоза-М17 растворе при температуре 30 °C в течение 24 ч в той же агар среде. Для заквасок, которым не хватает колоний в некоторых питательных средах (например, Pane Casereccio del Molise, Bozza Pratese, Pane di Altopascio Tradizionale, Bastone di Padova, Pane Casereccio Marchigiano и Pagnotta del Dittaino PDO для глюкоза-M17 агар), больше колоний было взято из среды, где колонии выросли, для того, чтобы начать изоляцию из 20 колоний для каждой закваски. Все изоляты, рассмотренные в ходе дальнейших анализов, смогли окислить культуральную среду. Исходные культуры хранились при температуре − 20 °C в 10% (объем/объем). Количество дрожжей было подсчитано на солодовом экстракте агара (MEA) и сабуро-декстрозном агаре (SDA) (Oxoid) в среде, обогащенной хлорамфениколем (0,1 г l− 1) при температуре 30 °С в течение 48ч. Произвольно выбранные колонии (10 для каждой среды, за исключением заквасок Pane di Genzano PGI и Bozza Pratese, которые не имели колоний в агаре с солодовым экстрактом, вследствие чего 20 колоний были собраны с чашек Петри (SDA)) дрожжей c высшим разведением чашек были подкультивированы в солодовом экстракте или декстрозном бульоне Сабуро и введены в ту же агар среду. Изоляты дрожжей подвергались следующим фенотипическим анализам: способность к ферментации галактозы, сахарозы, мальтозы, раффинозы и трегалозы и способность к росту при температуре 37 °C (3).

Характеристика генотипа при помощи анализа RAPD-PCR (ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК).

Геномная ДНК молочнокислых бактерий была извлечена по методу де Лос-Рейес-Гавилан и др. (14). Три олигонуклеотида: P1 (5′-GCGGCGTCGCTAATACATGC-3′), P4 (5′-CCGCAGCGTT-3′), и M13 (5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′), с произвольно выбранными последовательностями были использованы для биотипирования изолятов молочнокислых бактерий. Реакционная смесь и условия PCR анализа для праймеров P1 и P4 были описаны Де Ангелисом и др. (10). Условия PCR для праймера M13 соответствовали данным Сирагуза и др. (38). Произвольно амплифицированные полиморфные профили ДНК (RAPD)-PCR были получены с помощью системы документации Gel Doc 2000 и были сравнены при помощи оборудования снятия отпечатков II Informatix Software (Bio-Rad Laboratories). Сходство электрофоретических профилей оценивалось путем определения коэффициентов сходства Дайса и использованием невзвешенного попарно-группового метода с применением алгоритма средних связей (UPGMA). Поскольку профили RAPD изолятов из одной партии каждого типа закваски были подтверждены путем анализа изолятов из двух других партий, штаммы, изолированные из одной партии, были дополнительно проанализированы.

Геномная ДНК была извлечена из дрожжевых изолятов, как описано Кардинали и др. (5). Анализ RAPD-PCR с праймером (GACA)4 с рассеянными повторяющимися последовательностями (iSSR) был использован для определения дрожжей на уровне штаммов. Протокол PCR был ранее описан Андраде и др. (2), PCR был выполнен с ферментом EuroTaq (EuroClone, Милан, Италия) в одноградиентном термоциклическом аппарате (EuroClone). Сходство электрофоретических профилей оценивалось путем определения коэффициентов сходства Дайса и использования алгоритма UPGMA. Так как профили RAPD изолятов из одной партии каждого типа закваски были подтверждены путем анализа изолятов из двух других партий, штаммы, полученные из одной партии, были дополнительно проанализированы.

Генотипическая идентификация молочнокислых бактерий и дрожжей.

Идентификация штаммов проводилась с использованием двух пар праймеров (Invitrogen Life Technologies, Милан, Италия), LacbF/LacbR и LpCoF/LpCoR, для амплификации гена 16S рРНК молочнокислых бактерий (13). Праймеры, предназначенные для гена recA, также использовались для выявления видов L. plantarum, Lactobacillus pentosus и Lactobacillus paraplantarum с использованием многолокусного PCR (40). Праймеры PheS были использованы для идентификации на уровне видов в пределах родов Enterococcus, Weissella, и Leuconostoc (30). Праймеры casei/para использовались для определения видов Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus (48).

Геномная ДНК была извлечена из дрожжей методами, описанными выше. Домен D1/D2 гена 26S рРНК был амплифицирован и секвенирован в соответствии с процедурой, описанной Курцманом и Робнеттом (26). Электрофорез проводился на агарозном геле при 1,5% (вес/объем) (Gellyphor; EuroClone), ампликоны были очищены с помощью PCR ДНК с глюкозой, фруктозой и ксилитом, гелевым набором для очистки (GE Healthcare). Данные секвенирования электроферограммы были обработаны с помощью Geneious. Выравнивание последовательностей генов rRNA было выполнено с использованием метода множественного выравнивания последовательностей (17), а запросы идентификации были выполнены с помощью поисковой системы BLAST (1) в базе генетических данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/).

Статистический анализ.

Данные (по крайней мере три биологические репликации) для мальтозы, глюкозы, фруктозы, свободных аминокислот, рН, органических кислот, этанола и плотности клеток были подвергнуты одностороннему дисперсионному анализу (ANOVA), а парное сравнение методов обработки было достигнуто при помощи метода Туки при P < 0.05 с использованием программы для статистического анализа Statistica для Windows (Statistica 6.0 для Windows 98). Анализ главных компонентов (PCA) с использованием корреляционной матрицы был осуществлен для визуализации влияния ингредиентов и технологических параметров на микрофлору закваски и влияния микрофлоры на биохимические особенности закваски. Для каждой закваски был составлен профиль микробного сообщества, отражающий качественное (количество видов) и количественное (количество штаммов на вид) разнообразие молочнокислых бактерий и дрожжей (36). Химический состав муки (концентрация мальтозы, глюкозы, фруктозы, а также общие и отдельные свободные аминокислоты) или другие ингредиенты и микробное сообщество (плотность клеток молочнокислых бактерий и дрожжей, количество видов, количество штаммов и процент облигатно гомоферментативных и облигатно и факультативно гетероферментативных молочнокислых бактерий были использованы в качестве переменных для анализа PCA. Кроме того, были проанализированы данные микробного сообщества вместе с биохимическими характеристиками (рН, органические кислоты, коэффициент ферментации, этанол и свободные аминокислоты) заквасок (36). Все данные были стандартизированы до анализа PCA с помощью программы для статистического анализа Statistica для Windows. Кластерный анализ проводился также с использованием данных о ингредиентах и микробном сообществе или данных о микробных и биохимических характеристиках. Для кластерного анализа был применен метод невзвешенной парной группы с использованием арифметических средних (UPGMA), и были выражены сходства с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Групповой анализ был также использован для выбора групп заквасок и наложения доверительного эллипса на график счетов анализа PCA. Для проверки групп, сформированных в PCA, был выполнен АNOVA на составляющих графика PCA.

По сравнению с мукой из мягкой пшеницы мука из твердой пшеницы характеризовалась более высокими концентрации (средние значения) мальтозы (0,61 по сравнению с 0,21%), глюкозы (0,47 по сравнению с 0,25%), фруктозы (0,43 по сравнению с 0,26%), и общим содержанием свободных аминокислот (0,95 по сравнению с 0,58 г кг-1)) (см. Таблицу S1 в дополнительных материалах). В частности, концентрации серина, аланина, валина, лейцина, гистидина и лизина, а также треонина, глутаминовой кислоты, глицина, цистеина, тирозина, триптофана и белка были выше (примерно в 1,5 раза и в 2 раза соответственно) в муке из твердых сортов пшеницы, чем в муке из мягкой пшеницы (см. Таблицу S1 в дополнительных материалах).

Зрелые закваски показали значения рН в диапазоне от 3,70±0,02 (среднее значение± погрешность) (Pagnotta del Dittaino PDO) до 4,28±0,02 (Pane Casereccio di Reggio Calabria) (Таблица 2). Тринадцать из 19 заквасок имели значения рН менее 4,0 (среднее значение 3,97). Концентрации D,L-молочной кислоты соответствовали значениям рН и колебались от 63,7 до 94,0 мМ (среднее значение 80,0 мМ). Среднее значение концентрации уксусной кислоты составило 18,0 мМ с вариациями от 6,0 до 20,6 мМ. За исключением Pane di Altopascio Tradizionale все остальные закваски показали низкие и аналогичные коэффициенты ферментации в диапазоне от 3,3±0,30 до 5,6±0,14. Среднее значение концентрации этанола составило 0,24 М. 5-й и 95-й процентилы данных закваски составили 0,05М (Pane di Matera PGI) и 0,50М (Pane Casereccio Marchigiano), соответственно. Водорастворимые экстракты 19 итальянских заквасок содержали различные концентрации свободных аминокислот. Диапазон был от 339,6±16,9 до 1090,5±54,5 мг кг -1 (Таблица 2). Среднее значение составило 590,9 мг кг-1. Закваски Pane di Laterza, Pane Casereccio di Reggio Calabria и Pane Casereccio Marchigiano были распределены между 75-м и 95-м процентилями (625,2 и 763,5 мг кг-1, соответственно). Резко отклоняющиеся значения были у заквасок Pane nero di Castelvetrano (1 090,5±54,5 мг кг-1), Pane di Cappelli (361,7±18,0 мг кг-1) и Bastone di Padova (339,6 и 16,9 мг кг-1). По сравнению с первоначальными концентрациями содержание свободных аминокислот варьировалось индивидуально и в целом (данные не представлены). Среди всех заквасок закваски Pane di Matera и Pane di Altopascio Tradizionale отличались самыми высокими концентрациями γ- аминомасляной кислоты (ГАМК) (около 68 и 20 мг кг-1, соответственно).

Перечисление молочнокислых бактерий и дрожжей.

Определение количества микроорганизмов посевом на чашках Петри с использованием среды с четырьмя культурами показало различные значения предполагаемых молочнокислых бактерий (рис. 1). Помимо среды культивирования и с учетом наивысшего значения для каждой закваски среднее количество микроорганизмов посевом на чашках Петри составило 9,01 log КОЕ г-1. 25-й и 75-й процентили собранных данных составили 8,75 и 9,13 log КОЕ г-1, соответственно. Это различие можно объяснить качественными и количественными различиями между средами с точки зрения питательных веществ и различных метаболических возможностей штаммов, содержащихся в каждой закваске. Почти аналогичные различия значений плотности дрожжевых клеток были обнаружены между средой агара с солодовым экстрактом и средой декстрозного агара Сабуро (рис. 2). Независимо от среды культивирования и с учетом наивысшего значения для каждой закваски, среднее значение составило 7,30 log КОЕ г-1. Соотношение между молочнокислыми бактериями и дрожжами 19 итальянских заквасок варьировалось от 100:1 до 10:1, единственными исключениями являются закваски Pane di Matera PGI (приблизительно 1000:1) и Pane Casareccio di Genzano PGI (приблизительно 1:1).

Типирование и идентификация молочнокислых бактерий.

Грамположительные, каталаза-отрицательные, неподвижные кокки и палочки, способные окислить питательную среду Мозера-Рогоза-Шарпа, бульонную питательную среду Сабуро с глюкозой, питательную среду MRS5, или бульон глюкозы-М17 (411 изолятов) были подвергнуты анализу RAPD-PCR (таблица 3). Воспроизводимость отпечатков RAPD была оценена путем сравнения продуктов PCR, полученных праймерами P1, P4, и M13 и ДНК, извлеченными из трех отдельных культур одного и того же штамма. Для этого было изучено 10 штаммов, и модели для одного и того же штамма были схожи приблизительно на 90% (данные не предоставлены) согласно анализу UPGMA. Комбинированные профили RAPD были подвергнуты кластерному анализу UPGMA (данные не предоставлены). На основе воспроизводимости анализа RAPD-PCR изоляты, показывающие значительно (P<0,10) отличающиеся профили, были подвергнуты дальнейшему анализу. Штаммы были определены путем секвенирования по крайней мере 700 bp гена 16S рРНК (таблица 3). Кластерный анализ профилей RAPD показал, что разнообразие между изолятами варьировалось от 2 до 33%. Штаммы, показывающие профили RAPD с максимальным уровнем разнообразия 10%, были сгруппированы в один кластер. Таким образом, удалось сгруппировать около 50% штаммов в 23 кластерах (пронумерованных от I до XXIII). В целом, кластеризация штаммов не была связана с заквасками, из которых они были изолированы. Закваски содержали следующие виды: Weissella cibaria, Weissella confusa, Leuconostoc citreum, L. sanfranciscensis, L. plantarum, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Lactobacillus sakei, Pediococcus pentosaceus, L. paralimentarius, Lactobacillus gallinarum, Lactococcus lactis subsp. lactis, L. brevis, Pediococcus inopinatus, L. casei, Pediococcus argentinicus, L. rossiae, Weissella paramesenteroides, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus namurensis и Enterococcus durans (Таблица 3; также см. Таблицу S2 в дополнительных материалах).

Типирование и идентификация дрожжей.

Предварительно, 382 дрожжевых изолята (около 20 для каждой закваски) были проанализированы на способность ферментировать галактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу и трегалозу, а также на способность к росту при температуре 37°С. По крайней мере 6 изолятов для каждой закваски, включая все изоляты, демонстрирующие различные профили ферментации (данные не предоставлены), были генетически охарактеризованы и идентифицированы. Кластерный анализ профилей iSSR-PCR показал уровень разнообразия среди изолятов в диапазоне от 3 до 54% (данные не предоставлены). Изоляты, показывающие профили iSSR-PCR с максимальным уровнем разнообразия 10%, были сгруппированы в одном кластере. Таким образом, удалось сгруппировать 127 изолятов в 13 кластерах (I-XIII), в то время как 11 не были кластеризованы. За исключением Pane di Matera PGI, Coppia Ferrarese PGI и Pane di Cappelli, все закваски содержали изоляты, распределенные по двум или более кластерам. Штаммы были идентифицированы путем частичного анализа последовательности гена 26S рРНК (данные не предоставлены). S. cerevisiae были идентифицированы во всех заквасках, за исключением заквасок Pane di Cappelli, Pane nero di Castelvetrano, и Pagnotta del Dittaino PDO. C. humilis были идентифицированы в заквасках Pane di Terni, Pane di Cappelli и Pagnotta del Dittaino PDO. K. barnettii и K. exigua были идентифицированы в закваске Pane nero di Calstelvetrano

Статистическая корреляция между ингредиентами, технологическими параметрами, разнообразием микробных видов и биохимическими характеристиками закваски.

Анализ PCA показал, что тип муки коррелирует с микрофлорой закваски (рис. 3). Он показал только два значимых главных компонента (ГК), которые объяснили 47,09% (ГК1) и 11,20% (ГК2) общей дисперсии данных. Был также проведен кластерный анализ данных ингредиентов и микробных сообществ (рис. 4). Кластерный анализ также использовался для выбора кластеров заквасок на графиках счетов PCA (рис. 3 и 4).4). Согласно результатам ANOVA каждый эллипс на графике счетов PCA статистически (P<0.001) отличался от других (данные не предоставлены). Все закваски из твердой пшеницы были сгруппированы при расстоянии между кластерами 107%, в то время как закваски из мягкой пшеницы были сгруппированы при 97%. На расстоянии между кластерами 100% были обнаружены три кластера. В целом закваски из твердой пшеницы (кластеры I и II) коррелировали с i) высоким процентом облигатно гетероферментативных видов молочнокислых бактерий, (ii) низким процентом факультативно гетероферментативных и облигатно гомоферментативных видов молочнокислых бактерий и (iii) низкой плотностью клеток дрожжей.

Однако среди заквасок из твердой пшеницы закваски Modizzosu (партии закваски Modizzosu обозначены буквенно-цифровым кодом, начинающимся с Q), Pane Carasau (R), Pane di Lentini (T), and Pagnotta del Dittaino PDO (U), сгруппированные в кластере II, можно отличить от других при помощи низкой концентрации серина и общего содержания свободных аминокислот, особенно для T и U заквасок. Modizzosu (Q) и Pane Carasau (R) также характеризовались наибольшим количеством штаммов дрожжей и видов молочнокислых бактерий.

В заквасках из мягкой пшеницы были обнаружены некоторые различия. Pane Casereccio di Reggio Calabria (E), Pane Casereccio del Molise (F), Bozza Pratese (H) и Pane Casareccio di Genzano PGI (G) были отмечены самыми высокими концентрациями свободных аминокислот. Кроме того, закваски Pane Casereccio di Reggio Calabria (E), Pane Casereccio del Molise (F), и Bozza Pratese (H) были охарактеризованы высоким процентом облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий среди заквасок из мягкой пшеницы. В отличие от них Pane di Altopascio Tradizionale (I) и Pane Casereccio Marchigiano (O) были отмечены самыми низкими концентрациями свободных аминокислот.

Анализ главных компонент ингредиентов, помимо состава муки (процент NaCl, процент пекарских дрожжей, и процент закваски, используемой повторно), технологические параметры (время и температура использования закваски), и микрофлора закваски показали, что плотность дрожжевых клеток и процент пекарских дрожжей были взаимосвязаны, в то время как оба параметра были обратно зависимы от плотности клеток молочнокислых бактерий. Других связей обнаружено не было (данные не предоставлены).

Что касается взаимосвязи между микробными сообществами и биохимическими характеристиками закваски, два главных компонента объяснили около 55,25% общей вариации данных (рис. 5). Кластерный анализ сгруппировал закваски в два основных кластера (A и B), связанных друг с другом на 125% (рис. 6). При расстояние между кластерами 100% закваски были сгруппированы в три кластера. Кластер I сгруппировал большинство заквасок, демонстрируя высокий процент облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий, и коррелировал с высокой концентрацией уксусной кислоты (рис. 5 и 6).6). В кластер I вошли все закваски из твердой пшеницы с двумя исключениями - Pane di Lentini (T) и Pane Carasau (R), а также 3 закваски из мягкой пшеницы (Pane Casereccio di Reggio Calabria, E, Pane Casereccio del Molise, F, и Bozza Pratese, H).

Закваски Coppia Ferrarese PGI (N), Bastone di Padova (M), Pane Casereccio Marchigiano (O), Pane Casareccio di Genzano PGI (G), Pane di Lentini (T) и Pane Carasau (R) были сгруппированы вместе (кластер II), так как все они имели (i) высокий процент факультативно гетероферментативных штаммов молочнокислых бактерий, (ii) низкий процент облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий, и (iii) высокую плотность дрожжевых клеток. Закваски Pane di Altopascio Tradizionale (I) и Pane di Terni (L) (кластер III) отличались самым высоким процентом облигатно гомоферментативных штаммов молочнокислых бактерий. Закваска Pane di Altopascio Tradizionale также имела высокую концентрацию молочной кислоты и самое высокое значение коэффициента ферментации (рис. 5 и 66).

Данное исследование описывает микрофлору молочнокислых бактерий и дрожжей 19 заквасок, используемых для производства традиционных/стандартных итальянских видов хлеба. Количество жизнеспособных клеток отличалось в зависимости от среды, особенно для молочнокислых бактерий (32, 42). Соотношение между молочнокислыми бактериями и дрожжами 19 итальянских заквасок варьировалось от 100:1 до 10:1, что характерно для заквасок (см. ссылки 19 и 22). Исключениями стали закваски Pane di Matera PGI (приблизительно 1000:1) и Pane Casareccio di Genzano PGI (приблизительно 1:1). Количество штаммов варьировалось от 5 до 17. Хотя количество изолятов, вероятно, было недостаточным, чтобы описать все видовое разнообразие проанализированных заквасок, количество видов молочнокислых бактерий также заметно различалось у итальянских заквасок. Не было обнаружено какого-либо характерного для всех заквасок вида молочнокислых бактерий. За исключением Pane di Montecalvo Irpino и Pane Casereccio del Molise, все закваски имели своеобразный состав видов молочнокислых бактерий. Численно, наиболее часто встречающиеся изоляты принадлежали виду L. sanfranciscensis (приблизительно 28% от общего количества изолятов молочнокислых бактерий), L. plantarum (приблизительно 16%) и L. paralimentarius (приблизительно 14%), которые были обнаружены в 12, 10 и 5 итальянских заквасках, соответственно. L. sanfranciscensis считается одним из наиболее важных видов заквасок I типа (16). L. plantarum является широко распространенным видом, обнаруженным в некоторых пищевых экосистемах (7), включая закваски (19). В целом, стабильная стойкость L. sanfranciscensis и L. plantarum в заквасках объясняется (i) уникальным центральным метаболизмом и/или транспортировкой связанных с закваской углеводов (15, 20), (ii) активированными протеолитическими ферментами (20), (iii) особыми реакции на адаптацию к стрессу (12) и (iv) синтезом противомикробных соединений (18). Предыдущая характеристика закваски Pane di Matera PGI показала преобладание L. plantarum и L. mesenteroides (50). L. plantarum и L. brevis являются видами, наиболее часто изолируемыми из заквасок итальянской области Молизе (33). Несколько лет назад была исследована закваска Pane di Altamura PDO; L. plantarum были определены как доминирующим вид (33a). Результаты этого исследования частично отличались от результатов некоторых предыдущих исследований. В частности, W. cibaria и W. confusa были доминирующим видом, обнаруженным в закваске Pane di Altamura PDO. Эти различия могут быть связаны со следующими факторами: i) пекарни и методология анализа (например, количество образцов и изолятов, температура, рН и питательная среда) (35, 36), ii) загрязнение и условия пекарни (36) и в частности, iii) нестабильность микрофлоры закваски во время регулярного многоразового использования, которая зависит от типа муки и связанных с ним автохтонных молочнокислых бактерий (29, 38). Действительно, стабильная микрофлора в течение длительного периода времени была описана лишь в случае с несколькими заквасками, которые используются в качестве единственного разрыхлителя (4, 18, 37).

S. cerevisiae оказались наиболее часто изолируемым видом дрожжей. Эти результаты соответствовали предыдущим исследованиям закваски из центральных и южных районов Италии (31, 39). Доминирование нескольких штаммов S. cerevisiae может быть связано с загрязнением пекарскими дрожжами (45). Доминирование C. humilis было установлено в закваске Pagnotta del Dittaino PDO (21). K. barnettii и K. exigua были изолированы только из закваски Pane nero di Castelvetrano. K. exigua ранее была изолирована из ряда заквасок (16), в то время как присутствие K. barnettii в пшеничных заквасках было зафиксировано только в одной предыдущей работе (45).

Данное исследование показало, что тип муки (из твердой пшеницы или из мягкой пшеницы), а также концентрация некоторых питательных веществ муки, необходимых для микроорганизмов, доминирующих в экосистеме закваски, может играть ключевую роль для выбора популяции молочнокислых бактерий. Основными отличительными чертами закваски, изготовленными из муки из твердых сортов пшеницы, были высокие концентрации мальтозы, глюкозы, фруктозы и свободных аминокислот, соответствующие единственному или доминирующему наличию облигатно гетероферментативных молочнокислых бактерий, малое количество факультативно гетероферментативных иолочнокислых бактерий, и низкая плотность клеток дрожжей. Как ранее писали другие авторы (34, 36), в микрофлоре шести из девяти заквасок из мягкой пшеницы доминировали факультативно гетероферментативные молочнокислые бактерии. Только в трех заквасках из мягкой пшеницы (Pane Casereccio di Reggio Calabria, Pane Casereccio del Molise, и Bozza Pratese) облигатно гетероферментативные молочнокислые бактерии были обнаружены в качестве доминирующего вида молочнокислых бактерий, что соответствовало результатам предыдущих исследований (16). Так как эти закваски (наряду с закваской, используемой для Pane Casareccio di Genzano PGI) были основаны на муке с самой высокой концентрацией сбраживаемых углеводов и свободных аминокислот среди муки из мягкой пшеницы, можно предположить, что в муке с более низкой концентрацией таких питательных веществ (например, Bastone di Padova, Coppia Ferrarese PGI, и Pane Casereccio Marchigiano), облигатно гетероферментативные молочнокислые бактерии являются менее конкурентоспособными, чем факультативно гетероферментативные и / или облигатно гомоферментативные молочнокислые бактерии. Реакции переаминирования аминокислот и/или метаболические пути аргининдезиминазы – метаболическая деятельность, которая способствуют производству энергии, является кофактором переработки, и/или толерантности к кислотному стрессу и, следовательно, способствует конкурентоспособности и доминированию некоторых видов молочнокислых бактерий, обнаруженных в заквасках (16). Кроме того, свободные аминокислоты и гамма-аминомасляные кислоты, произведенные молочнокислыми бактериями, могут увеличить питательную ценность хлеба. Например, количество ГАМК в 150 г Pane di Matera PGI представляет собой минимальную эффективную суточную дозу, оказывающую положительный эффект на организм людей (25). В целом, добавление пекарских дрожжей негативно сказалось на конечной плотности клеток молочнокислых бактерий. Тем не менее, дальнейшие исследования необходимы для выявления специфического эффекта каждого технологического параметра (процент NaCl, процент пекарских дрожжей, процент закваски, используемой регулярно и многократно, а также время и температура использования) на состав микрофлоры (46).

Данное исследование использовало системный и сравнительный подход при рассмотрении микрофлоры молочнокислых бактерий и дрожжей многочисленных заквасок, используемых для производства традиционных/ стандартных видов итальянского хлеба. Структура микрофлоры отличала почти все исследованные закваски. Это, в свою очередь, повлияло на биохимические особенности (концентрация молочных, уксусных кислот, этанола и свободных аминокислот) закваски. Результаты этого исследования могут быть полезны для выбора конкретных стартовых культур. Это должно гарантировать высокое качество, характеризующее традиционный и/или стандартный хлеб.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была осуществлена при поддержке Beldem S.A. (Анден, Бельгия).

Мы благодарим Франческо Маццакане (Факультет биологии, химии и сельского хозяйства, Университет Бари Альдо Моро, Италия) за техническую помощь. Мы также благодарим все пекарни за сотрудничество.

Дополнительные материалы для этой статьи можно найти на http://aem.asm.org/